羅氏實時熒光定量PCR儀（LightCycler®系統(tǒng)）工作原理

實時熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種結(jié)合PCR擴(kuò)增和熒光檢測的技術(shù)，能夠?qū)NA或RNA進(jìn)行精確定量。羅氏（Roche）的LightCycler®系列儀器（如LightCycler® 480）采用閉管檢測方式，通過監(jiān)測PCR過程中熒光信號的變化，實現(xiàn)核酸的實時定量分析。其核心工作原理可分為以下幾個部分：

1. PCR擴(kuò)增與熒光檢測的結(jié)合

實時熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上引入熒光標(biāo)記探針或染料，使擴(kuò)增過程可以被實時監(jiān)測。羅氏LightCycler®系統(tǒng)的主要檢測方式包括：

(1) 基于熒光探針的檢測（如TaqMan探針）

• 探針結(jié)構(gòu)：

• 探針兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)（如FAM）和淬滅基團(tuán)（如TAMRA或BHQ）。

• 探針與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合。

• 工作原理：

• 在PCR延伸階段，Taq DNA酶發(fā)揮5'→3'外切酶活性，切割探針，使報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離。

• 報告基團(tuán)釋放熒光信號，其強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量成正比。

(2) 基于DNA結(jié)合染料的檢測（如SYBR Green）

• 染料特性：SYBR Green可非特異性地結(jié)合雙鏈DNA，并在激發(fā)后發(fā)出熒光。

• 檢測方式：

• 每輪PCR循環(huán)后，檢測熒光強(qiáng)度，反映雙鏈DNA的累積量。

• 需配合熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）驗證擴(kuò)增特異性。

2. 光學(xué)檢測系統(tǒng)

羅氏LightCycler®儀器采用多通道熒光檢測，主要流程如下：

1. 激發(fā)光源：LED或鹵素?zé)籼峁┨囟úㄩL的激發(fā)光（如470nm、530nm等）。

2. 熒光采集：

• 光學(xué)傳感器在每輪PCR循環(huán)后掃描各孔熒光信號。

• 支持多重檢測（如FAM、HEX、ROX、Cy5等不同熒光通道）。

3. 信號處理：

• 軟件記錄熒光強(qiáng)度變化，生成擴(kuò)增曲線（Amplification Plot）。

3. 定量分析原理

(1) 閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）

• Ct值（Threshold Cycle）：熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)。

• 定量依據(jù)：

• 初始模板量越高，Ct值越小；反之，Ct值越大。

• 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法（絕對定量）或ΔΔCt法（相對定量）計算目標(biāo)核酸濃度。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法（絕對定量）

1. 使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如質(zhì)粒DNA）進(jìn)行梯度稀釋并擴(kuò)增。

2. 繪制Ct值-log(起始拷貝數(shù))標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 根據(jù)待測樣本的Ct值，計算其初始模板量。

(3) 熔解曲線分析（特異性驗證）

• 適用情況：使用SYBR Green等非特異性染料時。

• 原理：

• PCR結(jié)束后，緩慢升溫（如60°C→95°C），使雙鏈DNA解鏈。

• 監(jiān)測熒光信號隨溫度的變化，生成熔解曲線。

• 單一峰表示特異性擴(kuò)增；多峰提示引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。

4. 羅氏LightCycler®系統(tǒng)的技術(shù)特點

1. 快速溫控：

• 采用Peltier半導(dǎo)體技術(shù)，升降溫速率可達(dá)4.8°C/秒，縮短實驗時間。

2. 多重檢測能力：

• 支持4–6色熒光通道，可同時檢測多個靶標(biāo)（如病原體分型）。

3. 閉管操作：

• 減少開蓋污染風(fēng)險，提高檢測穩(wěn)定性。

5. 應(yīng)用示例

• 病毒載量檢測（如HIV、HBV）：通過Ct值定量病毒RNA/DNA。

• 基因表達(dá)分析（qRT-PCR）：比較不同樣本中mRNA的相對表達(dá)量。

• 突變檢測：結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）分析SNP或點突變。

6. 注意事項

• 引物/探針設(shè)計：需確保特異性，避免交叉反應(yīng)。

• 防污染措施：使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）降解殘留PCR產(chǎn)物。

• 儀器校準(zhǔn)：定期進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)和溫度驗證，保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

總結(jié)

羅氏實時熒光定量PCR儀通過熒光標(biāo)記探針或染料實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增，結(jié)合多通道光學(xué)檢測和Ct值分析，實現(xiàn)核酸的精確定量。其核心技術(shù)優(yōu)勢在于快速溫控、多重檢測和閉管操作，適用于臨床診斷、科研及工業(yè)檢測等領(lǐng)域。實驗成功的關(guān)鍵在于優(yōu)化反應(yīng)體系、規(guī)范操作流程并定期維護(hù)儀器。